LA PHOTO-AUTOTROPHIE AU CARBONE

A L'ECHELLE DES MOLECULES


Les végétaux chlorophylliens absorbent une partie de l'énergie lumineuse qu'ils reçoivent pour réaliser les synthèses de matière organique. Comment cette énergie est-elle convertie en énergie chimique? Comment l'assimilation du dioxyde de carbone est-elle réalisée? Quelle est l'origine du dioxygène dégagé?

1 La chlorophylle:

L'étude de l'activité photosynthétique de végétaux à feuilles panachées montre que ceux-ci ne réalisent de synthèses qu'au niveau des zones chlorophylliennes. Quels rôles jouent les pigments photosynthétiques dans l'absorption des radiations lumineuses?

1.1 PREPARATION D'UNE SOLUTION ALCOOLIQUE DE CHLOROPHYLLE BRUTE

Broyez dans un mortier à l'aide d'un pilon, des feuilles de persil ou d'épinard avec du sable siliceux (qui casse les cellules), du carbonate de calcium pour neutraliser les acides organiques) et de l'alcool à 95°. Filtrez le mélange.

Le filtrat, d'un beau vert, est une solution alcoolique de chlorophylle additionnée d'autres pigments comme nous allons le constater.
Il est possible également de procéder à la séparation des pigments foliaires par solubilité différentielle.
Nous nous contenterons de procéder à celle qui suit.

1.2 SEPARATION DES PIGMENTS PAR CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE SUR PAPIER

1.1 Principe:
Cette technique utilise comme principe l'équilibre qui s'établit pour des corps dissous entre deux solvants partiellement miscibles, l'un mobile, l'autre stationnaire. Une substance est entraînée par le solvant mobile d'autant plus rapidement que sa solubilité dans ce solvant est plus grande et sa solubilité dans le solvant fixe plus faible.

1.2 Protocole expérimental:

1 à 2 cm de l'extrémité d'une feuille de papier Whatman n°1 écrasez proprement 4 ou 5 rondelles de feuilles d'épinard découpées à l'emporte-pièce en évitant ensuite de laisser des débris (1). Introduisez la feuille de papier dans une éprouvette contenant un solvant (85% d'éther de pétrole + 10% d'acétone + 5% de cyclohexane), munie d'un bouchon et d'un crochet, de manière à ce que le papier trempe dans environ 1cm de solvant (2), sans que la tache y baigne et que le papier touche les parois de l'éprouvette (3).


Après quelques dizaines de minutes, maintenu à l'obscurité, le chromatogramme (4) montre:

vers le bas, une tache verte de chlorophylle b,
plus haut, une tache verte plus sombre, de chlorophylle a,
une tache jaune de xanthophylle,
une tache orangée de carotène.


1.3 Quelques propriétés:
La chlorophylle est détruite par les acides qui lui donnent une teinte jaune brunâtre (cf: brunissement des feuilles en automne après l'accumulation d'acides organiques).
La chlorophylle a une réaction acide: traitée par une base, elle donne un chlorophyllate d'un beau vert (cf. traitement des légumes au bicarbonate de sodium).
La chlorophylle est rouge en lumière réfléchie (fluorescence: schéma ci-contre), verte en lumière transmise.

La solution de chlorophylle, extraite de la plante, réagit à une excitation lumineuse par l'émission d'une lumière rouge (fluorescence). Dans les conditions naturelles elle transmet cette énergie à d'autres molécules et retourne à l'état initial.

1.3 ABSORPTION DE LA LUMIERE PAR LES PIGMENTS CHLOROPHYLLIENS


Voyons comment il est possible de décomposer la lumière blanche, c'est-à-dire comment obtenir un spectre.

On interpose sur le trajet d'un faisceau de lumière blanche une cuve transparente contenant une solution alcoolique de chlorophylle brute.
Les rayons qui émergent de la cuve sont ensuite dirigés sur un prisme de façon à décomposer la lumière (diffraction de la lumière).
Le spectre d'absorption de la chlorophylle brute peut ainsi être comparée au spectre d'émission de la lumière blanche.

Comparez les deux spectres: que constatez-vous? Que pouvez-vous dire des radiations lumineuses qui ont traversé la solution de chlorophylle?


Nous pouvons utiliser un spectrophotomètre pour analyser d'une façon relativement précise la longueur d'onde des radiations absorbées par notre solution brute de chlorophylle.
Pour cela nous sélectionnons sur le spectrophotomètre des radiations de longueur d'onde comprises entre 325 et 900 nm, tous les 25 nm. Sur le trajet du faisceau lumineux, nous interposons une petite cuve pour mesures photométriques, qui contient la solution brute de chlorophylle confectionnée précédemment, et nous mesurons le coefficient d'absorption (en valeurs arbitraires).


Si l'appareil est doté d'une sortie analogique, nous le relions, via une interface, à un ordinateur doté d'un logiciel de traitement graphique des données, sinon, nous entrons, au clavier les valeurs mesurées dans un tableur-grapheur.
Une expérience de ce type a donné les résultats relatées par le graphe ci-contre. Quelle précision chiffrée pouvez-vous apporter à votre réponse précédente?


Comme notre solution brute de chlorophylle est constituée de plusieurs pigments, il serait intéressant de connaître le spectre d'absorption de chacun d'eux. Extraits puis séparés par chromotographie, les différents pigments (chorophylle a, chlorophylle b et carotène) sont analysés séparément et leurs spectres comparés avec le spectre global de la solution brute.


Formulez votre analyse de façon chiffrée. Sachant que les proportions respectives de chacun de ces pigments diffèrent selon les espèces, n'est-il pas possible d'émettre une hypothèse quant à la contribution de chacun d'eux à la fonction chlorophyllienne?

1.4 EFFICACITE PHOTOSYNTHÉTIQUE DES DIFFERENTES RADIATIONS DANS LA PHOTOSYNTHESE

L'absorption des radiations de la lumière blanche par la chlorophylle est une chose, mais leur efficacité dans le processus photosynthétique en est une autre. Les radiations absorbées sont-elles toutes aussi efficaces?

Dans un bécher, versez un volume de 5 ml de solution tamponnée (2 volumes de solution de NaHCO3, soit 2 ml et 3 volumes de tampon phosphate, soit 3 ml). Avec des ciseaux, découpez dans ce bécher, une jeune tige d'Elodée ou de Cabomba en fins fragments et introduisez le tout dans l'enceinte expérimentale qui recevra la sonde oxymétrique. Installez la sonde photométrique comme l'indique le schéma. Ouvrez le logiciel de traitement de données. Un graphe vide apparaît avec une barre de menus: procédez aux réglages, les expériences pourront commencer.

La sonde photométrique permet d'obtenir un éclairement identique avec les différents filtres et la lumière blanche en réglant le potentiomètre qui accompagne le projecteur. La sonde thermométrique permet de contrôler la température qui doit rester constante pendant les mesures afin de ne pas faire intervenir ce paramètre dans les résultats.
On étudie l'influence des radiations bleues, vertes, rouges obtenues avec des filtres monochromatiques pendant des phases de 3 min séparées par 1 min d'obscurité et celle de la lumière blanche.


Des résultats obtenus dans des laboratoires ont ainsi permis, dans les mêmes conditions, de comparer le spectre d'absorption et le spectre d'action des pigments photorécepteurs, comme le montre le graphe ci-contre. Quelle conclusion pouvez-vous dégager?

2 La phase photochimique de la photosynthèse

La réduction du dioxyde de carbone nécessite de l'énergie. Quelle relation peut-on faire entre l'absorption de la lumière et l'acquisition d'un pouvoir réducteur par les cellules chlorophylliennes?

2.1 HISTORIQUE

En 1937, le biologiste HILL constate que des chloroplastes isolés par broyage de feuilles dans des solutions de pH convenable et renfermant 10% de saccharose provoquent l'oxygénation du pigment rouge de sang de vertébré, l'hémoglobine, en présence d'un sel ferrique. Le dégagement de dioxygène provient de l'oxydation de l'eau:

Ainsi:

2.2 RAPPEL DE CHIMIE:

La réduction d'un élément chimique M consiste en un gain d'électrons pour celui-ci; une oxydation est une perte d'électrons. Oxydation et réduction sont couplées:


De ce fait le passage d'un transporteur d'électrons de l'état oxydé à l'état réduit exige un apport d'énergie.

2.3 PRINCIPE DE L'EXPERIENCE DE HILL:

Les chloroplastes intacts contiennent un transporteur oxydé ( R ) qui est réduit par les électrons provenant de l'eau ( RH2 ); celui-ci disparaît dans les chloroplastes altérés.
On étudie le dégagement de dioxygène dans une suspension de chloroplastes exposés à la lumière, en présence ou en l'absence d'un accepteur d'électrons artificiel (qui remplace le transporteur naturel R): le ferricyanure de potassium (Fe3+ oxydant); il a la possibilité de jouer le rôle d'accepteur d'e- et d'être réduit en Fe2+.



Dans le chloroplaste ont lieu les réactions d'oxydo-réduction suivantes:

2.4 PROTOCOLE EXPERIMENTAL

On broie des feuilles de lis dans un mortier entouré de glace (évite la destruction des enzymes) et contenant 2,5ml de tampon tri-saccharose (neutralise les acides organiques susceptibles de détruire les enzymes). On ajoute 10ml de P-saccharose et on continue à broyer pendant 1min. On filtre sur gaze et coton en pressant. On dilue éventuellement avec du P-saccharose. On contrôle au microscope la présence de chloroplastes libres et l'absence de cellules intactes.

La suspension de chloroplastes (5ml) est mise dans une enceinte expérimentale alternativement à l'obscurité puis à la lumière, en l'absence ou en présence de ferricyanure de potassium à doses différentes.

Quelles sont les conditions nécessaires à la production de dioxygène que révèle l'expérience de HILL?

2.5 ORIGINE DU DIOXYGENE: L'EXPERIENCE DE RUBEN ET KAMEN (1941)

Si l'on revient à l'équation-bilan de la photosynthèse:
6 CO2 + 12 H2O ----> C6H12O6 + 6 O2 + 6 H2O
le dioxygène dégagé pourrait théoriquement provenir soit de l'eau (H2O), soit du dioxyde de carbone (CO2). Qu'en est-il?

2.6 BILAN DE CES REACTIONS PHOTOCHIMIQUES: LA PHOTOLYSE DE L'EAU

La phase claire de la photosynthèse, faite de réactions nécessitant la lumière, est une suite de réactions complexes. La rédaction ci-dessous tente d'intégrer les exigences du programme sans tomber ni dans une simplification vulgarisatrice, ni dans une complexité rébarbative.
Résumé: la lumière provoque:

3 La deuxième phase de la photosynthèse: l'incorporation du CO2

Il apparaît nécessaire, au terme de nos investigations, de distinguer, dans le processus de photosynthèse, les mécanismes énergétiques qui résultent de la conversion de la lumière en énergie disponible (production d'ATP) au cours desquels la cellule chlorophyllienne acquiert des propriétés réductrices et les mécanismes synthétiques au cours desquels la matière minérale (dioxyde de carbone) est réduite pour aboutir à la synthèse de molécules organiques. Il convient de rapporter ici les expériences, maintenant historiques, qui révèlent les grandes étapes de la photosynthèse et principalement celles qui montrent l'incorporation de dioxyde de carbone dans la matière organique.

3.1 LES EXPERIENCES DE GAFFRON ET COLL. (1951)

Du dioxyde de carbone radioactif (14CO2) est fourni à une suspension d'algues unicellulaires (chlorelles) fortement éclairée. Dans un premier temps on dose le 14CO2 fixé (graphe de gauche), dans un second temps on dose le dioxygène dégagé (graphe de droite).


Que constate-t'on tant que la suspension d'algues reste éclairée? quand elle passe à l'obscurité?
Que devrait-il se passer si la lumière était directement indispensable à l'incorporation de CO2?

3.2 LES EXPERIENCES DE CALVIN ET BENSON (1962)

Des chlorelles sont maintenues en suspension à la lumière, dans un récipient où l'on fait barboter du dioxyde de carbone. Celles-ci sont refoulées dans une tubulure souple et transparente qu'elles parcourent en un temps donné grâce à une pompe dont le débit est connu.
En un point variable de la tubulure, on injecte du 14CO2: le temps pendant lequel les algues peuvent l'incorporer est variable selon l'endroit de l'injection.
Les cellules tombent enfin dans du méthanol bouillant qui bloque instantanément toutes les réactions chimiques. Par radio-chromatographie CALVIN et BENSON déterminent les molécules organiques qui ont incorporé le 14C en fonction du temps de mise en présence des algues avec le dioxyde de carbone radioactif.

Parmi les composés identifiés:




Quelle est la première molécule organique formée après incorporation du CO2?


On essaye de comprendre les relations existant entre les autres composés mis en évidence et leurs liens avec la phase photochimique de la photosynthèse.

3.3 COUPLAGE AVEC LA PHASE PHOTOCHIMIQUE:

Des chlorelles sont cultivées dans un milieu où barbote de l'air enrichi en 14CO2. La culture, éclairée dans un premier temps, est subitement mise à l'obscurité. On mesure la radioactivité de deux composés organiques: le ribulose bi-phosphate ou C5P2, l'APG.

Que traduit la chute de ribulose bi-phosphate et la hausse d'APG lorsque la suspension est placée à l'obscurité? Cette hausse se maintient-elle? Emettez une hypothèse explicative. Comprenez-vous pourquoi on dit que la phase "sombre" (ne nécessitant pas la lumière) est couplée à la phase "claire" ou photochimique?

3.4 BILAN DE LA PHASE "SOMBRE" DE LA PHOTOSYNTHESE

C'est la synthèse de molécules organiques à partir du CO2 et de protons et d'électrons fournis par les transporteurs au cours d'un cycle complexe de réactions couplées aux réactions de la phase "claire"; elle a lieu dans la matrice du chloroplaste et ne nécessite pas la présence de lumière.

3.4.1. Formation d'acide phosphoglycérique à partir du ribulose-biphosphate (ou C5P2) qui fixe une molécule de CO2 pour donner 2 molécules d'acide phosphoglycérique à 3 atomes de C.

3.4.2. Formation de triose-phosphate (ou C3P) à partir de l'acide phosphoglycérique qui entre dans un cycle de réactions complexes (cycle de CALVIN) au cours desquelles il est réduit par l'oxydation du transporteur d'électrons (RH2); l'hydrolyse de l'ATP fournit l'énergie indispensable à cette synthèse qui n'exige pas la présence de lumière:

ATP -----> ADP + Pi + énergie

3.4.3. Synthèse de nombreuses molécules organiques à partir du triose-phosphate, comme:

des glucides à 5 atomes de C (par exemple ribulose-biphosphate régénéré au cours du cycle de CALVIN),

des glucides à 6 atomes de C comme le glucose, précurseurs de molécules essentielles comme le saccharose ou l'amidon,

des lipides,

des acides aminés, des protides, des acides nucléiques.

L'ensemble de ces réactions (endergoniques) ou anabolisme consomme de l'énergie qui est fournie par l'ATP.

4 Le devenir des produits de la photosynthèse

Les substances organiques élaborées lors de la photosynthèse sont distribuées dans toute la plante et les zones non chlorophylliennes d'une plante se comportent comme des parties hétérotrophes d'un être autotrophe. Les substances qui ne sont pas utilisées immédiatement sont accumulées dans des organes spécialisés.

4.1 MISE EN EVIDENCE DE RESERVES GLUCIDIQUES:

4.1.1 L'amidon: les graines (blé, maïs, seigle,...), les tubercules (pomme de terre, manioc, ...) sont des organes qui mettent en réserve ce polyoside de formule (C6H10O5)n.

4.1.2 l'inuline: certains tubercules, comme le dahlia mettent en réserve cet autre polyoside. Il est possible de le mettre en évidence par cristallisation en présence d'alcool.

Grattez la section d'une pomme de terre, d'une graine de blé préalablement ramollie dans de l'eau pendant plusieurs heures. Montez entre lame et lamelle dans une goutte de Lugol et observez au microscope.
Montez une coupe mince de tubercule de dahlia, conservé dans l'alcool, dans une goutte de glycérine. Observez au microscope.
Rendez-compte de vos observations par un dessin.

4.2 MISE EN EVIDENCE DE RESERVES PROTIDIQUES

Réserves protéiques dans la graine de haricot:

Après avoir fait ramollir des graines de haricot dans de l'eau, placez-en quelques-unes dans un tube à essai, recouvrez de sulfate de cuivre et laissez agir une minute. Rincez à l'eau et versez ensuite de la soude. Que constatez-vous au bout de quelques instants?
Cette réaction, caractéristique des liaisons peptidiques, appelées "réaction du Biuret" révèle ici la présence de protides.

Expliquez l'importance de la mise en réserve de substances organiques pour la pérennité d'une espèce végétale.